1.NESCs和ICC肠壁内共移植治疗HSCR的实验研究2.IL-6/STAT3蛋白表达与Wilms瘤进展的关系
【摘要】背景无神经节巨结肠病即先天性巨结肠病(Hirschsprung’sdisease,HSCR),是一种严重危害婴幼儿身心健康的先天性畸形。病变肠段神经节细胞缺失或发育不良,伴随Cajal间质细胞(interstilialcellofCajal,ICC)缺失或分布异常是其主要病理变化。目前对于先天性巨结肠病的病因和发病机制尚未完全阐明,一般认为该病是由遗传因素和环境因素共同作用而导致的一种先天性遗传疾病。研究表明,肠壁内存在着一个神经调节网络称为肠神经系统(entericnervoussystem,ENS),它能相对独立的调节消化系统的运动功能。肠神经系统中的神经元细胞和神经胶质细胞由神经嵴细胞迁移、分化而来。在胚胎发育过程中神经嵴细胞向原始消化管迁入障碍或迁入的神经嵴细胞分化异常均会引起消化管神经运动障碍性疾病的发生。近年来众多的实验研究证实了神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)移植治疗神经系统退行性疾病和神经损伤性疾病的可行性,提示NSCs移植有望成为治疗消化管神经运动障碍性疾病的新方法。来源于早期神经管壁的神经上皮干细胞(neuroepithelialstemcells,NESCs)除了具有干细胞的基本特征能自我更新和分化之外,还具有取材方便、容易分离培养和扩增的优势以及较低的免疫原性。同时因NESCs具有神经嵴细胞的分化潜能,使其成为细胞移植治疗消化管神经运动障碍性疾病较为理想的供体细胞。在肠道神经丛及肠平滑肌细胞之间还存在一种来源于原始消化管中胚层的间充质细胞,即Cajal间质细胞(ICC)。ICC被称为胃肠慢波活动的起搏细胞,可通过与肠神经丛中的神经节细胞形成突触连接而参与兴奋性及抑制性神经递质的传递。ICC对维持胃肠动力的正常运行至关重要,其缺乏或减少与多种胃肠动力障碍性疾病相关,如先天性巨结肠病、慢传输性便秘、肥大幽门狭窄和假性肠梗阻等。目前ICC已经成为胃肠动力研究的热点,已有研究通过酶解法结合密度梯度离心技术将消化管中的ICC分离出来并进行体外培养,为进一步研究该细胞的功能和相应的细胞信号转导机制奠定了实验基础。鉴于该病主要病理改变是由于神经嵴细胞迁入或分化障碍,以及ICC数量或分布异常所引起,因此从理论上讲,该病理想的治疗方法就是补充缺失的神经节细胞和ICC,即细胞移植治疗。自1978年Sato等首先用苯扎氯铵(benzalkoniumchloride,BAC)选择性破坏大鼠肠神经节细胞并成功建立类似于人类先天性巨结肠病的大鼠模型之后,该方法即被广泛应用于该病的实验研究。但关于BAC对肠道内ICC影响的报道甚少。因此本课题在前人研究的基础上,选择利用化学试剂：苄基-二甲基-十四烷基氯化铵(BAC)制作类似于人类先天性巨结肠病的大鼠模型,观察BAC对肠壁内神经节细胞及ICC的影响,并在该大鼠模型上进行NESCs和ICC共移植,检测移植细胞在肠壁微环境中存活、分化和功能状况,并观察细胞移植后的治疗效果,从而进一步揭示先天性巨结肠病的发病机理,并为该病的治疗开辟一条新路。方法本研究通过显微解剖和机械吹打方法分离培养孕11.5天大鼠胚胎神经管来源的NESCs,采用酶消化结合密度梯度离心法自新生Wistar大鼠结肠肌层内分离出ICC,并通过免疫细胞荧光染色的方法对提取的细胞进行鉴定。采用0.5%阳离子表面活性剂BAC选择性地去除大鼠一段降结肠的肠神经节细胞,建立HSCR大鼠模型并在组织学上进行鉴定。分为三组进行移植：NESCs移植组、ICC移植组、NESCs和ICC共移植组。将5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记的NESCs和4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenylindole,DAPI)标记的ICC移植到HSCR模型大鼠BAC处理肠段。移植后8周,取移植处肠管,利用透射电镜观察移植细胞的存活情况；通过免疫荧光双染和Westernblot技术检测肠壁内移植细胞的分化情况。并行离体肌条电场刺激实验和结肠测压球囊扩张刺激反射实验来评估细胞移植后肠运动功能的恢复情况。结果免疫细胞化学染色检测结果显示,NESCs呈Nestin阳性,能分化为微管相关蛋白2(microtubuleassociatedprotein2,MAP2)阳性的神经元细胞和胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)阳性的神经胶质细胞。分离培养的ICC呈c-Kit阳性,自胞体发出数条突起,可与邻近ICC突起相互连接形成网络状。BAC作用后4周,PGP9.5、GFAP和c-Kit免疫荧光染色和透射电镜结果均显示模型组BAC处理段肠壁内神经节细胞及ICC消失,而对照组可见正常分布的神经节细胞及ICC。细胞移植后8周,透射电镜结果显示移植细胞存活良好,免疫荧光双染显示移植的NESCs能分化为蛋白基因产物9.5(proteingeneproduct9.5,PGP9.5)阳性的神经元细胞和GFAP阳性的神经胶质细胞,移植的ICC呈c-Kit阳性。NESCs和ICC共移植组移植细胞较单独移植组分化为更多的PGP9.5阳性的神经元细胞(P＜0.05)。Westernblot检测显示胆碱乙酰转移酶(cholineacetyltransferase,ChAT)和神经型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase,nNOS)在NESCs和ICC共移植组的表达明显升高(P<0.05)。离体肌条电场刺激实验和结肠测压球囊扩张刺激反射实验结果表明共移植组结肠神经运动功能明显恢复。结论本研究在巨结肠病大鼠模型上将NESCs和ICC进行肠壁内共移植,证明了ICC能促进NESCs向肠神经元细胞方向的分化及肠神经运动功能的恢复,证明了肠壁内多种细胞移植治疗先天性巨结肠病的可行性,为细胞移植治疗该病提供了新思路。背景肾母细胞瘤是小儿腹部最常见的恶性实体瘤,其发病率约为0.01%。在过去的数十年中,综合治疗使患儿的长期生存率明显提高,但仍有10%左右的肿瘤患儿因发生复发或转移预后较差。目前关于导致wilms肿瘤转移和复发的主要生物学因素依然未知。近年来的研究表明,炎症在肿瘤发生、发展过程中扮演着重要的角色,其中一些分子机制已逐渐被阐明。肿瘤发生与进展受到多种炎症相关生长因子和细胞因子的影响,包括白介素6(interleukin-6,IL-6)。IL-6通过与靶细胞表面的IL-6受体(IL-6receptor,IL-6R)结合激活IL-6R复合物从而导致下游JAK-STAT3信号通路的活化,促进细胞的增殖、运动和侵袭。本研究拟通过检测小儿Wilms肿瘤组织中IL-6和STAT3(signaltransducerandactivatoroftranscription3)蛋白的表达水平评价其与肿瘤侵袭、转移和预后的关系。方法采用免疫组化S-P三步法检测58例原发Wilms肿瘤组织和18例侵袭或转移灶中IL-6与STAT3蛋白的表达水平。结果IL-6在58例Wilms肿瘤原发灶和18例侵袭或转移灶中的阳性率表达分别为39.7%(23/58)和61.1%(11/18)。STAT3在58例Wilms肿瘤原发灶和18例侵袭或转移灶中的阳性率表达分别为29.3%(17/58)和33.3%(6/18)。IL-6和STAT3在侵袭或转移组中的表达高于对照组(P=0.033；P=0.012)。IL-6和STAT3的表达均与病理组织类型相关(P=0.013；P=0.027)。STAT3蛋白的表达差异在各临床分期和患儿年龄间有统计学意义(P<0.05)。在76例Wilms肿瘤组织中IL-6和STAT3蛋白表达具有正相关性(P<0.001,r=0.444)。IL-6和STAT3蛋白在18例原发灶及其对应的侵袭或转移灶中的表达均具有一致性(P=0.727：P=1.000)。IL-6蛋白表达水平和病理组织类型与患儿的无疾病生存期(disease-freesurvival,DFS)和总生存期(overallsurvival,OS)相关(P=0.025；P=0.037),而STAT3只与DFS相关(P=0.004),与0S无关(P=0.102)。结论IL-6和STAT3蛋白表达与肿瘤侵袭、转移和预后相关,这为进一步了解Wilms肿瘤浸润和转移的机制及靶向治疗提供新的思路。
【作者】张丽娟；
【导师】吴荣德；
【作者基本信息】山东大学，儿科学，2014，博士
【关键词】神经上皮干细胞；Cajal间质细胞；先天性巨结肠病；细胞移植；大鼠；Wilms肿瘤；IL-6；STAT3；浸润；转移；进展；
【参考文献】
[1]阎岩.BRM调控动脉平滑肌细胞表型转化在胸主动脉夹层及胸主动脉瘤形成中的作用[D].第二军医大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[2]白雪松,徐汝兴,郑巧英.数字图书馆的个性化推送服务[J].图书馆杂志,2005,09:25-28.
[3]陈明明.视频中的车辆检测及车型识别研究[D].南京邮电大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[4]王鹏.HS传媒集团资金集中管理研究[D].河北工业大学,工商管理,2013,硕士.
[5]徐英卓.数据仓库在钻井工程决策中的应用研究[J].计算机工程与应用,2003,25:199-201.
[6]曹政才,马逢乐,付宜利,张剑.基于Gabor能量空间的尺度不变兴趣点检测方法(英文)[J].自动化学报,2014,10:2356-2363.
[7]朱凯旋.弱相互作用对ASEP模型中SSB抑制作用的研究[D].安徽大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[8]于永学.煤矿综合信息平台系统的设计与实现[D].天津大学,软件开发,2012,硕士.
[9]李勇明.基于DSP的交流稳流源数字控制研究[D].浙江大学,电力电子与电力传动,2004,硕士.
[10]张柯.木材烘干控制系统控制过程研究与实现[D].吉林大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[11]童鹏飞.基于解耦理论的中国土地利用变化与经济增长关系研究[D].沈阳师范大学,土地资源管理,2013,硕士.
[12]左璐.媒介环境学视野下移动互联网传播及其影响研究[D].四川外国语大学,文艺学,2014,硕士.
[13]杨东升.受阻胺光稳定剂行业废水利用研究[D].天津大学,化学工程,2013,硕士.
[14]张宇萌,谢阳群.我国网上技术市场现状及发展模式[J].生产力研究,2004,05:88-89.
[15]王军.工科大学生人际交往能力归因特点的研究[D].华东师范大学,基础心理学,2002,硕士.
[16]李庆庆.休宁县旅游业发展对策研究[D].合肥工业大学,旅游管理,2013,硕士.
[17]黄联平.中美MPA教育的比较研究[D].华中师范大学,教育经济与管理,2003,硕士.
[18]马守芳.工业建筑设计中轻型钢结构的特点与设计方法[J].建材发展导向,2014,10:.
[19]李丛.话题熟悉度对阅读中词汇附带习得影响的实证研究[D].西安外国语大学,课程与教学论,2014,硕士.
[20]朱正群,刁楚朋.新机研制中新材料和热加工工艺的应用[J].航空工艺技术.1997(05)
[21]田军.我国大学英语写作教学课堂中应用同学相互建议的教学方法之研究[D].西北工业大学,语言学与应用语言学,2003,硕士.
[22]全湘.规划设计实施的遗憾[J].规划师.1995(04)
[23]马瑜.中国经济雁阵式跨越“中等收入陷阱”的问题研究[D].大连海事大学,产业经济学,2013,硕士.
[24]雷冰贤.甘肃省金融支农效率研究[D].兰州商学院,金融学,2013,硕士.
[25]王羽.一次急性力竭运动后大鼠肝TMPRSS6、TWSG1及肠铁吸收的动态变化[D].河北师范大学,运动人体科学,2014,硕士.
[26]李玲.增强型血流显像及频谱多普勒对高尿酸血症患者眼动脉的血流动力学研究[D].川北医学院,影像医学与核医学,2014,硕士.
[27]杜胜.低空飞行器安全控制技术研究[D].哈尔滨工业大学,飞行器设计,2013,硕士.
[28]张滢鸿.中国城市机构养老问题研究[D].山东师范大学,政府管理（专业学位）,2013,硕士.
[29]刘超然.桥式起重机网络化协同设计系统研究与开发[D].中北大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[30]柴陵江.基于侧向速度估计的主动前轮转向与横摆力矩集成控制研究[D].上海理工大学,车辆工程,2011,硕士.
[31]万博鹏.艾灸对Alzheimer病模型大鼠JNK信号通路及细胞凋亡相关因子影响的研究[D].湖北中医药大学,针灸推拿学,2014,博士.
[32]李小莉.多晶铁纤维雷达波吸收性能的研究[D].太原理工大学,材料加工工程,2004,硕士.
[33]陈卫民,陈国呈,崔开涌,曹大鹏,张翼,吴春华.分布式并网发电系统在孤岛时的运行控制[J].电力系统自动化,2008,09:88-91.
[34]马冰琼.壮泰语派生构词法的对比及教学对策研究[D].广西民族大学,亚非语言文学,2013,硕士.
[35]连梅.清能集团财务控制优化设计研究[D].中国地质大学（北京）,工商管理,2014,硕士.
[36]冯彩云.近自然园林的研究及其植物群落评价指标体系的构建[D].中国林业科学研究院,园林植物与观赏园艺,2014,博士.
[37]孟秀梅.清末民初蒙旗矿产开发若干问题研究[D].内蒙古大学,专门史,2014,硕士.
[38]李世雨.热痹外用方巴布剂治疗热痹疗效观察[D].北京中医药大学,中医学,2013,硕士.
[39]缪宇春.冷季型草坪草耐热性与交播效果评价[D].南京农业大学,园林植物与观赏园艺,2013,硕士.
[40]朱海霞.浙江省科技型中小企业融资结构影响因素的实证分析[D].浙江大学,2007.
[41]李锋.共同富裕理论视角下民生问题研究[D].辽宁大学,科学社会主义与国际共产主义运动,2012,硕士.
[42]艾则孜江·艾尔肯.黑果枸杞的真伪鉴别及质量研究[D].北京中医药大学,药物分析,2014,硕士.
[43]刘可.叶兆言和厄普代克作品中的悲剧美比较[D].辽宁大学,比较文学与世界文学,2012,硕士.
[44]杜鹏.陕西县级公立医院改革研究[D].西北大学,公共管理（专业学位）,2014,硕士.
[45]宋立芳.长沙县金井镇流域氮磷养分输出特征及其影响因素[D].华中农业大学,环境科学,2014,硕士.
[46]程雅玲.福建移动单点登录系统的设计与实现[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[47]陈晓君.新产品开发不同阶段知识转移绩效的影响因素研究[D].浙江大学,2008.
[48]程军照,李澍森,陈江波,雷云飞,李勇,郭慧浩.对低压接地相关标准的异议[J].电力系统自动化,2012,20:113-117.
[49]李婕.农业机械类汉语新词语的英译[D].湖南师范大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[50]朱海涛,徐建明,何德峰,邢科新,丁毅.基于最小均方delta规则的神经网络工件识别[J].浙江工业大学学报,2014,02:219-224+236.
